감옥에서 탈출한 국사범 안젤로티가 죄수복을 입은 채 누이동생이 가르쳐 준대로 성당에 숨어들었다가, 거기서 그림을 그리던 친구 카바라도시를 우연히 만난다. 안젤로티를 돕기로 한 카바라도시는 만일의 경우 자기 별장 정원의 낡은 우물에 비밀 지하실에 숨으라고 한다. 그때 대포 소리가 울리고, 탈옥이 발각됐다고 생각한 두 사람은 곧 떠날 준비를 하고 성당에서 나간다.엇갈려서 등장한 성당지기 앞에 스카르피아가 경관들을 데리고 나타나 도망간 국사범을 찾기 위해 구석구석 조사하라고 명한다. 경관이 점심 바구니를 발견하여 가지고 오자 성당지기는, 카바라도시는 손도 대지 않았다고 말하고, 스카르피아는 안젤로티가 먹었다고 판단한다.

그때 토스카가 들어오자 스카르피아는 아타반티 가의 부채를 꺼내 보이며, 분명 누가 떨어뜨렸다고 토스카의 질투심을 선동하고, 그녀는 그의 계략을 모른 채 카바라도시의 변절에 분개한다.카바라도시를 체포한 스카르피아는, 토스카를 부르고, 죄수를 숨긴 사실을 부인하는 그를 그녀 앞에서 고문한다. 아무 말 말라는 카바라도시가 부탁이 있었지만, 그의 고통스런 신음 소리를 견디지 못한 토스카는 안젤로티의 행방을 말해버린다. 하지만 발각된 안젤로티는 자살하고, 이제 카바라도시를 죽이려는 스카르피아에게 토스카는 할 수 없이 그녀의 애정을 허락한다. 이에 스카르피아는 카바라도시를 거짓 총살하라고 명하면서 스폴레타에게 의미 있는 눈짓을 보낸다.

토스카는 카바라도시와 외국으로 도망가기 위해 출국 허가서를 요구하고, 스카르피아가 이를 준비하는 동안, 책상 위에 있는 칼을 몰래 집어 다가오는 스카르피아를 찔러 죽인다. 허가서를 손에 쥔 토스카는 카바라도시에게 가 자신이 스카르피아를 죽인 것과 거짓 사형에 대해 얘기하고, 죽은 연기를 잘 하라고 조언한다. 그러면서 둘은 자유의 몸이 될 수 있음을 기뻐한다. 병사들이 나타나 총을 쏘고 퇴장하자 토스카는 쓰러진 카바라도시 곁에 다가가지만 그는 진짜 죽어있다. 그리고 스카르피아를 살해범인 그녀를 잡기 위해 경찰들이 몰려들자 토스카는 흉벽에서 몸을 날려 자살한다.